Biopsja płynna

Według Światowej Organizacji Zdrowia (www.globocan.iarc.fr) w 2012 roku nowotwory złośliwe wykryto u 7 410 376 mężczyzn. W tym samym czasie z ich powodu zmarło 4 653 385 osób. Szacuje się, że w ciągu najbliższych dwóch dekad liczba chorych na nowotwory złośliwe zwiększy się niemal dwukrotnie i choroby nowotworowe staną się podstawowym, głównym problemem ówczesnej cywilizacji.

Nowotwory "urologiczne" stanowią prawie jedną czwartą nowotworów złośliwych stwierdzanych u mężczyzn. Najczęstszym z nich jest rak gruczołowy stercza (prostate cancer - PCa). W 2012 roku wykryto go u 1 094 873 mężczyzn, przy czym odnotowano jedynie 307 481 zgonów z jego powodu. PCa zajmuje drugie miejsce pod względem częstości występowania i piąte pod względem śmiertelności z powodu wszystkich nowotworów złośliwych. Wyliczono, że w okresie ostatnich 5 lat z rozpoznaniem PCa żyło 3 857 500 mężczyzn. To zjawisko tłumaczy się między innymi powolnym rozwojem PCa. Szacuje się, że guz podwaja swoją masę średnio po upływie 4 lat.

Wprowadzenie powszechnego oznaczania swoistego antygenu sterczowego (PSA) zrewolucjonizowało rozpoznawanie PCa. Zwiększyła się liczba chorych, u których leczenie radykalne było możliwe, liczba chorych na zaawansowanego PCa zmniejszyła się. W USA śmiertelność swoista dla PCa systematycznie zmniejsza się począwszy od 1995 roku. Niestety stwierdzono, że wraz z upowszechnieniem oznaczania PSA i wcześniejszym wykrywaniem zaawansowanych postaci raka obserwuje się niepokojąco dużą nadrozpoznawalność PCa, czyli wykrywanie nowotworów, które gdyby nie oznaczanie PSA, nie zostałyby wykryte. O mężczyznach z takim rozpoznaniem mówi się, że umarliby z rakiem, a nie z jego powodu. Nie dziwi więc bardzo duża liczba chorych, którzy przez wiele lat żyją z PCa i nierzadko umierają z innych niż rak powodów. Nadrozpoznawalność PCa stanowiła podstawowy argument użyty przez amerykańską instytucję USPSTF (US Preventive Services Task Force) odradzającą oznaczania PSA.

Od niedawna na "rynku medycznym" dostępne są leki, które wpływają korzystnie na przeżycie chorych na zaawansowane postaci PCa. Mechanizm działania poszczególnych leków jest jednak odmienny i kolejność ich stosowania pozostaje nieznana. Abirateron i enzalutamid mają charakter leczenia hormonalnego. Kabazytaksel jest lekiem cytostatycznym, a izotop radu oddziałuje na komórki PCa za pośrednictwem promieniowania alfa. Sipuleucel jest formą leczenia immunomodulującego. Nie wiadomo, który z nich przyniesie najbardziej korzystny skutek w grupie mężczyzn chorujących na PCa w podobnym stanie zaawansowania. Badania molekularne, których wyniki niedawno opublikowano [Gundem G, et al.: The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature 2015; 520: 353-357] dały podstawę do rozważań na temat domniemanej skuteczności leków o różnorodnym mechanizmie działania w poszczególnych przypadkach. Od osób zmarłych z powodu PCa pobrano fragmenty każdego ogniska nowotworowego i określono profil genetyczny budujących je komórek. Zauważono, że komórki tworzące różne ogniska mają swoiste mutacje nieobecne w obrębie innych przerzutów. Nazwano je leaf mutations (LF). Mutacje, które były wspólne dla wszystkich przerzutów, to znaczy ich obecność wykryto w komórkach budujących wszystkie zidentyfikowane ogniska, nazwano trunc mutations (TM). Te zaś, które występowały w co najmniej dwóch obszarach, nazwano branch mutations (BM). Jest zrozumiałe, że leki, których punkt uchwytu odpowiada zmianom wywołanym przez TM, będą skuteczne względem każdego ogniska PCa. Przeciwnie - te, których działanie będzie odnosić się jedynie do LF bądź BM, będzie cechowała mniejsza skuteczność. Przedstawiono wiele przypadków progresji PCa dziejącej się jakoby w "tle" rzekomo skutecznie leczonego hormonalnie mężczyzny. O skuteczności tego świadczyć ma niewielkie stężenie PSA. Tymczasem badania obrazowe dokumentują coraz większą liczbę przerzutów bądź zwiększenie ich wielkości. Wyniki wspomnianego badania tłumaczą to zjawisko. W praktyce klinicznej posługujemy się narzędziami, których celem jest wykrycie w skali makro następstw procesu biologicznego trwającego od dłuższego czasu. Dobry przykład stanowi PSA. Wiadomo, że wznowa biochemiczna po prostatektomii radykalnej wyprzedza progresję kliniczną o kilka lat. Niestety wraz z rozwojem PCa maleje znaczenie PSA jako markera nowotworowego. Znikome stężenie PSA po prostatektomii radykalnej wcale nie wyklucza przyszłej wznowy.

Wspomniane obserwacje stanowią przykład wyzwań, z którymi mierzy się współczesna uroonkologia. W przypadku PCa zwiększone stężenie PSA nie oznacza, że istnieje konieczność wykonania biopsji stercza. Prawidłowy wynik pierwszej biopsji nie znaczy, iż nie należy wykonać kolejnej. Wycięcie lub zniszczenie radykalne stercza nie musi świadczyć o doszczętności leczenia, mimo nieoznaczalnych wartości PSA. Podobnie niskie stężenie PSA nie zawsze sugeruje brak progresji PCa w toku leczenia hormonalnego. U chorych na raka opornego na wytrzebienie (CRPC) korzystny efekt leczenia immunomodulującego lub leczenia polegającego na podaniu radioizotopu radu nie koreluje ze stężeniem PSA. Poszczególne przerzuty u chorego na CRPC mogą reagować odmiennie na leczenie systemowe. Pobieranie wycinków z każdego z nich i ocena profilu genetycznego komórek je budujących nie są obecnie uzasadnione. Jedną z metod stanowiącą przedmiot intensywnych badań, która mogłaby rozwiązać niektóre ze wspomnianych dylematów, jest biopsja płynna.

Biopsja płynna

Termin "biopsja" powstał ze złożenia dwóch wyrazów: bios oznaczającego życie oraz opsis - obserwowanie, patrzenie. Wprowadzono go w połowie XIX wieku, by opisać badanie mikroskopowe tkanek pobranych w odróżnieniu od autopsji, czyli badania pośmiertnego. Biopsja płynna (liquid biopsy - LB) stanowi odpowiednik klasycznej biopsji, ale źródłem badanych komórek jest krew. W rzeczywistości przyjmuje się, że LB oznacza badanie materiału genetycznego wyizolowanego z krwi w poszukiwaniu określonej choroby/zjawiska. Jego źródłem mogą być komórki nowotworowe krążące we krwi (circulating tumor cells - CTC), chociaż LB odnosi się także do analizy wolnego, obecnego poza komórkami materiału genetycznego (circulating free DNA - cfDNA). U osób zdrowych ilość cfDNA jest bardzo mała. Znacząco wzrasta u chorych na nowonowotwory. Komórki nowotworowe uwalniają swój materiał genetyczny podczas apoptozy lub martwicy, ale także w wyniku sekrecji drobnych pęcherzyków zwanych egzosomami. DNA pochodzący od komórek nowotworowych nazywa się ctDNA (circulating tumor DNA). Uważa się, że analiza ctDNA ujawnia zaburzenia genetyczne obecne w każdym z ognisk nowotworowych, chociaż udział poszczególnych zmian w ogólnej puli ctDNA jest z pewnością różny. Oprócz cfDNA materiał genetyczny krwi stanowi RNA, w tym także mikroRNA. Badanie ctDNA może zatem dostarczyć wiarygodnych informacji dotyczących stanu, w którym znajduje się nowotwór niezależnie od charakteru i rodzaju leczenia.

Współczesne techniki biologii molekularnej pozwalają względnie szybko wyizolować z krwi i zbadać materiał genetyczny komórek nowotworowych. Pierwsze doniesienia dotyczyły jednak nie onkologii, lecz diagnostyki prenatalnej [Lun FM, Tsui NB, Chan KC, Leung TY, Lau TK, Charoenkwan P, et al.: Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relativemutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 19920-19925]. Okazało się, że dzięki LB można wykryć trisomie chromosomów 21., 18. i 13. u płodów i tym samym zastąpić inwazyjną amniopunkcję biopsją płynną. W onkologii w 2014 roku po raz pierwszy przedstawiono dowody na użyteczność kliniczną oznaczania "wolnego" materiału genetycznego (cfDNA) we krwi, którego względna ilość korelowała z czasem przeżycia chorych w dwuletniej obserwacji [Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, et al.: Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014; 6: 224ra24].

Schemat biopsji płynnej przedstawia rycina 1. cfDNA izoluje się z osocza powstałego po odwirowaniu 10 ml

Rycina 1	Schemat biopsji płynnej (wg CHRONIX BIOMEDICAL; www.chronixbiomedical.com/connect/technology)

Rycina 2	Schemat przedstawiający rodzaje analizy cfDNA i jej interpretacje (wg CHRONIX BIOMEDICAL; www.chronixbiomedical.com/ connect/technology)

Rycina 3	Schemat przedstawiający wynik LB u 5 'zdrowych' osób (A) oraz u 5 chorych na PCa mężczyzn (B). Obszary genomu odmienne od stanu prawidłowego są zaznaczone kropkami zielonymi (więcej powtórzeń danego fragmentu DNA niż w warunkach prawidłowych - gains) lub czerwonymi (mniej powtórzeń danego fragmentu DNA niż w warunkach prawidłowych - losses)

krwi, którą wcześniej pobrano od badanej osoby. Po wyodrębnieniu materiału genetycznego następuje jego sekwencjonowanie i porównanie z prawidłowym materiałem genetycznym człowieka. Dzięki temu wiadomo, która część genomu jest niewłaściwie reprezentowana u badanej osoby. Analizę cfDNA można prowadzić co najmniej dwukierunkowo - poszukując znanej, wcześniej określonej mutacji (badanie jakościowe) bądź analizując łącznie ilość wszystkich zaburzeń genetycznych względem stanu prawidłowego (ryc. 2). W tym drugim przypadku wynik LB przedstawia się za pomocą wskaźnika CNI (copy number instability). CNI odzwierciedla liczbę powtórzeń danego regionu DNA w porównaniu do próbki pobranej wcześniej od tego samego chorego lub próbki pobranej od osoby zdrowej, której wynik został wprowadzony do bazy producenta testu. Wynik porównania stanowiący podstawę wyliczenia CNI można przedstawić graficznie (circos plot - tłum. schemat cyrkowy). Rycina 3 zawiera przykład wyniku LB u 5 zdrowych osób (3A).

Zastosowanie biopsji płynnej w urologii

W pierwszych akapitach tego opracowania wspomniano o rozpoznawaniu raka gruczołu krokowego. Ostatecznie PCa wykrywa się na podstawie biopsji stercza. Wskazania do jej wykonania, niezależnie od liczby wcześniej przebytych biopsji, stanowią nadal przedmiot licznych prac. Rocznie w USA wykonuje się ponad milion biopsji, przy czym PCa rozpoznaje się u około 200 tys. mężczyzn. U większości mężczyzn po biopsji obserwuje się miernie nasilone krwawienie z dróg moczowych bądź z dróg nasiennych. Co dwudziesty wymaga jednak hospitalizacji i jej powodem u większości z nich są powikłania septyczne. Jest zrozumiałe, że poszukuje się metod, które ograniczyłyby liczbę niepotrzebnie wykonywanych biopsji. Niedawno opublikowano wyniki badania, w którym oceniono znaczenie LB w grupie chorych na PCa i w grupie mężczyzn zdrowych. Zauważono, że współczynnik CNI był istotnie wyższy u 204 chorych na PCa (44; 95% CI: 30-67) niż u 207 pozostałych mężczyzn (9; 95% CI: 5-12) niedotkniętych tym nowotworem. Po analizie wyników tego badania opracowano komercyjnie dostępny test (Second Opinion^TM Prostate Cancer Evaluation), który można wykorzystać w toku ustalania wskazań do biopsji stercza. Dokładność tego badania w rozpoznawaniu PCa przekracza 90%. To oznacza, że Second Opinion^TM może być pomocny u tych, którzy chcą upewnić się co do konieczności powtórzenia biopsji w sytuacji, w której nadal występują klasyczne do niej wskazania. Test ten jest od niedawna dostępny na naszym rynku.

Plany dalszego rozwoju

Ustalanie wskazań do biopsji jest tylko jednym z wielu możliwych zastosowań LB w odniesieniu do chorych na PCa. Rak stercza jest przykładem spośród wielu nowotworów, względem których biopsja płynna może okazać się przydatna. W tabeli 1 podano potencjalne możliwości wykorzystania LB w codziennej praktyce uroonkologicznej. Jestem przekonany, że niedługo zaczniemy dyskutować na ich temat.

Tabela 1	Przykłady zastosowania biopsji płynnej w onkologii

Podsumowanie

Biopsja płynna stanowi przykład nowego rodzaju badań, które mogą zrewolucjonizować rozpoznawanie chorób nowotworowych i leczenie chorych nimi dotkniętych. Stanowi je badanie krwi, które jest pomocne w ustaleniu wskazań do biopsji stercza. Test Second Opinion^TM jest już dostępny na naszym rynku. Mam nadzieję, że w niedalekiej przyszłości biopsja płynna będzie wykorzystywana do rozwiązywania innych wątpliwości dotyczących PCa, w tym wyboru nowego sposobu leczenia i monitorowania jego skuteczności.

dr hab. n. med. Jakub Dobruch
Klinika Urologii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego
Oddział Urologii Europejskiego Centrum Zdrowia, Otwock
kierownik oddziału: dr hab. n. med. Jakub Dobruch

Do przygotowania niniejszego opracowania zostały wykorzystane materiały dostarczone przez CHRONIX BIOMEDICAL.