Plemniki w rozrodzie wspomaganym oraz transplantacja komórek rozrodczych

Opracowano na podstawie: Sperm Cell for Artificial Reproduction and Germ Cell Transplantation. Weidner Wolfgang H.G., Schuppe Hans-Christian, Pilatz Adrian, Altinkilic Bora, Diemer Thorsten. European Urology Supplements 2014; 13: 83-88.

Przez lata mężczyźni bez plemników w ejakulacie byli traktowani jako nieodwracalnie niepłodni. Po wprowadzeniu docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemników (intracytoplasmic sperm injection - ICSI) w 1992 roku można było im zaoferować leczenie poprzez chirurgiczne pozyskanie plemników z ich dróg rozrodczych. Ustanowiono światowe standardy i uzyskano wiele prawidłowych ciąż z zapłodnienia ICSI przy użyciu nasienia pochodzącego z jąder lub najądrzy. Współczynnik urodzeń dla tej metody jest podobny jak dla nasienia przygotowanego mechanicznie bądź enzymatycznie, lub które poddano krioprezerwacji. Istnieje światowy konsensus co do wskazań do pozyskania nasienia (tab. 1). Ogólnie rzecz ujmując, należy rozróżnić dwa scenariusze kliniczne:

• Mężczyźni z azoospermią obstrukcyjną (obstructive azoospermia - OA) - aspiracja nasienia z najądrzy, tradycyjna, nie mikroskopowa ekstrakcja nasienia z jądra (testicular sperm extraction - TESE) lub aspiracja nasienia poprzez biopsję cienkoigłową.
• Mężczyźni z azoospermią nieobstrukcyjną (nonobstructive azoospermia - NOA) - prawdopodobieństwo znalezienia prawidłowych wydłużonych spermatyd w nasieniu jest znacząco niższe, współczynnik pozyskania wynosi do 66% zależnie od populacji, wieloogniskowego pobrania i użycia technik mikrochirurgicznych w czasie TESE (m-TESE).

Tabela 1	Wskazania do pozyskania nasienia

Pozyskanie nasienia w azoospermii obstrukcyjnej

Pozyskanie nasienia podczas i po niepowodzeniu refertylizacji (wazowazostomia lub tubulowazostomia)

W czasach nowoczesnych technik wspomaganego rozrodu użyteczność procedur refertylizacji jest kwestionowana przez wielu ginekologów, mimo że istnieje powszechny konsensus, iż pozyskanie nasienia i ICSI powinny być stosowane tylko w razie niepowodzenia rekonstrukcji mikrochirurgicznej dróg nasiennych. Nawet w przypadkach powtórnej obustronnej wazowazostomii współczynnik odzyskania drożności dochodzi do nawet 85,9%, zaś po tubulowazostomii do 41-69%. Średni współczynnik ciąż wynosi około 74%, podczas gdy średni współczynnik ciąż dla ICSI/pozyskania plemników wynosi 25-39%. Dlatego w opinii ekspertów procedury pozyskania nasienia do IVF (In Vitro Fertilization)/ICSI powinny być stosowane tylko wtedy, gdy powtórna rekonstrukcja mikrochirurgiczna całkowicie zawiodła.

W niektórych przypadkach pary pytają o pozyskanie nasienia podczas procedur refertylizacji. Podczas wazowazostomii bezpośrednia aspiracja może być pomocna, chociaż starsze dane wykazują brak plemników w aspiracie z nasieniowodów u 27% pacjentów. Dla procedury tubulowazostomii autorzy sugerują dodanie trzypunktowej TESE, jeśli para wymaga tej procedury jako zabezpieczenia.

Pozyskanie nasienia z najądrzy

Mikrochirurgiczna aspiracja nasienia z najądrzy (microsurgical epididymal sperm aspiration - MESA) jest standardową procedurą w pozyskaniu nasienia w przypadku OA u mężczyzn, u których zabiegi refertylizacji nie przyniosły efektu lub u których występują schorzenia utrudniające rekonstrukcję. Skuteczność pozyskania nasienia dochodzi do 95%, nasienie może być użyte wielokrotnie dla kilku cykli IVF/ICSI. Wyjątkowym wskazaniem do wszystkich typów zabiegów z pobraniem nasienia z najądrzy są pacjenci z OA oraz małą objętością ejakulatu, kwaśnym pH, brakiem lub niską koncentracją fruktozy, brakiem α-glukozydazy i agenezją nasieniowodów. W tych przypadkach palpacja jest decydująca dla identyfikacji nasieniowodów. Badanie genetyczne pary w kierunku mutacji CFTR jest obowiązkowe z powodu ryzyka posiadania dziecka z mukowiscydozą lub niepłodnością.

MESA jest leczeniem z wyboru, z wysokim prawdopodobieństwem pozyskania dużej liczby ruchliwych plemników z minimalną kontaminacją krwią. MESA zwykle jest przeprowadzane w znieczuleniu ogólnym. Przezskórna aspiracja nasienia z najądrzy wydaje się być równie efektywna i może być przeprowadzona w znieczuleniu miejscowym. W obu technikach powikłania są nieistotne.

Pozyskanie nasienia z jąder

Teoretycznie w OA pobranie nasienia z najądrzy i jąder wydaje się być równie efektywne, ze skutecznością pobrań do 100%. Miejsce pobrania (jądra lub najądrza) nie ma wpływu na odsetek zapłodnień, ciąż czy żywych urodzeń. Przezskórna aspiracja nasienia może być także skuteczna. Pragmatycznie autorzy zalecają parom pobranie nasienia najpierw z głowy najądrzy, zwłaszcza w przypadku CBAVD (wrodzona aplazja nasieniowodów), i zmianę na pobranie z jąder, jeśli MESA okazała się nieskuteczna.

Ekstrakcja nasienia z jąder w azoospermi i nieobstrukcyjnej

Od czasu pierwszego skutecznego ICSI z użyciem plemnika pobranego z jądra minęło około 20 lat. Przez ten czas przeprowadzono wiele badań klinicznych w poszukiwaniu najlepszej techniki pobrania nasienia z jąder u pacjentów z NOA. W celu poprawy skuteczności pobrań zostały zaproponowane dwie innowacje chirurgiczne. Pierwsza, bazując na heterogeniczności spermatogenezy u pacjentów z NOA i przypadkowym rozmieszczeniu jej nieuszkodzonych obszarów w tkance jądra, polega na trzypunktowym TESE z pobraniem z górnego, środkowego i dolnego bieguna jądra, zwiększając szanse na skuteczne pobranie. Druga, M-TESE, identyfikuje poszerzone kanaliki nasienne z ogniskami nienaruszonej spermatogenezy bardziej wiarygodnie. Wyniki są generalnie doskonałe, współczynnik pobrań dochodzi do 60%, nawet u pacjentów ze złym rokowaniem.

Pomimo tych chirurgicznych ulepszeń, na podstawie przeglądu z bazy Cochrane w 2008 roku wnioskuje się o braku wystarczających dowodów, by rekomendować którąkolwiek technikę pobrań nasienia u mężczyzn z NOA. Wydaje się być racjonalne sugerowanie wielopunktowych pobrań oraz rozważenie M-TESE jako dodatkowej opcji dla uzyskania lepszych efektów w patologiach z różnymi rozmiarami kanalików nasiennych. Zwłaszcza w podgrupie mężczyzn z NOA z małymi jądrami i /lub wysokim poziomem FSH, kombinowane trzypunktowe i mikrochirurgiczne TESE daje skuteczność pobrań do 66%. W opinii autorów omawianego artykułu współczynnik skutecznych pobrań nasienia jest decydujący, dlatego można wprowadzić M-TESE jako standardową technikę pobrań nasienia.

Technicznie, na kombinowane trzypunktowe i mikrochirurgiczne TESE składają się trzy 1-centymetrowe poprzeczne cięcia: pośrodkowe, w górnym i dolnym biegunie oraz poszerzenie cięcia środkowego do pobrania mikrochirurgicznego. Przy użyciu mikroskopu (powiększenie x 25) identyfikuje się kanaliki o większej średnicy i dokonuje ich wycięcia sektorowego zgodnie z istniejącą strukturą przegrodową. Z każdego cięcia pobiera się 3 preparaty: jeden do kompleksowej oceny histopatologicznej (włączając w to ocenę pod kątem zmian TIN (testicular intraepithelial neoplasia); jeden do krioprezerwacji; jeden do szybkiego zamrożenia do dalszych badań molekularnych. Przy takim podejściu sukces pobrań jest ściśle związany z półilościową oceną skali spermatogenetycznej wyliczającą procent kanalików w biopsji wykazujących wydłużone spermatydy. Jako miejscowe powikłanie może powstać wewnątrzjądrowy krwiak, z którym zwykle postępuje się zachowawczo.

Pozyskanie nasienia, histopatologia tkanki jądrowej i jej przygotowanie

Ogólnie przyjęte jest, że najlepszym predyktorem skutecznego pobrania nasienia jest badanie histopatologiczne wykazujące plemniki/wydłużone spermatydy. Odkąd próbka do badania histopatologicznego jest pobierana podczas TESE, powstał dylemat dla operatora. Propozycja powtórnego TESE, jeśli pierwsze było nieskuteczne, zwykle nie jest akceptowana. Ostatnie doniesienia podkreślają wpływ różnego wyniku badania histopatologicznego, z lepszymi wynikami przy użyciu M-TESE w przypadku zespołu samych komórek Sertolego oraz w hipospermatogenezie, natomiast brak różnic w zakresie współczynnika pobrań w przypadku stwierdzenia zatrzymania dojrzewania (maturation arrest).

Autorzy omawianego artykułu sugerują używanie systemu oceny punktowej spermatogenezy (spermatogenic scoring system) z wyliczeniem procenta kanalików w biopsji wykazujących wydłużone spermatydy (tab. 2). Technicznie tkanka jądrowa może być bezpośrednio poddana krioprezerwacji, a następnie mechanicznej oraz enzymatycznej dyzagregacji do wydzielenia plemników po rozmrożeniu. Alternatywnie, plemniki mogą być wyizolowane z tkanki przed krioprezerwacją do ICSI. W innym badaniu autorów ta technika, która może być określana jako „diagnostyczne TESE”, ściśle koreluje z wynikiem punktowym badania histologicznego (dane nieopublikowane). Autorzy nie wykonują śródoperacyjnej mokrej analizy na bloku operacyjnym, gdyż wyniki są niewiarygodne. Wskazane jest posiadanie starannego zaplecza laboratoryjnego do poszukiwania spermatyd po preparacji mechanicznej i enzymatycznej. Rozbieżne wyniki z fałszywie ujemnym wynikiem oceny histopatologicznej dotyczą około 10% przypadków. W tych przypadkach wskazane są dodatkowe badania molekularne do wyszukania wydłużonych spermatyd, jak np. ekspresja protaminy.

Inne predyktory skutecznego pozyskania nasienia

Stężenie FSH i objętość jąder są czynnikami prognostycznymi, które muszą być ocenione u pacjentów z NOA przed zabiegiem. Nawet u pacjentów z ekstremalnie wysokim stężeniem FSH czy też z małą objętością jąder wciąż można znaleźć wydłużone spermatydy. W ostatnich badaniach nad M-TESE nie wykazano związku pomiędzy współczynnikiem pozyskania nasienia a wysokim stężeniem FSH. Inne badane parametry endokrynologiczne, jak np. inhibina-B czy hormon antymüllerowski, także nie są decydującym predyktorem sukcesu pobrania nasienia u pacjentów z NOA.

Tabela 2	System oceny punktowej spermatogenezy

Mikrodelecje chromosomu Y mają wartość prognostyczną z szansą na pozyskanie nasienia w 50% w przypadku mikrodelecji AZFc. Standardowy protokół autorów wyklucza mężczyzn, którzy mają całkowitą makrodelecję AZFa i AZFb oraz mikrodelecje chromosomu Y, gdyż prawdopodobieństwo znalezienia plemników jest znikome. Pacjenci z zaburzeniami kariotypu, np. z zespołem Klinefeltera, nie powinni być wykluczani z TESE. Z powodu zanikającej wraz ze starzeniem się spermatogenezy, wiek w czasie wykonania TESE może wpływać na wynik pobrania. Dodatkowo poziom testosteronu >8,7 nmol/l jest związany z lepszymi wynikami pobrań.

Okołooperacyjne leczenie hormonalne

Pierwotna niewydolność jąder jest zwykle związana z granicznym hipogonadyzmem. Niskie stężenie osoczowego testosteronu jest zwykle związane z niskim stężeniem jądrowego testosteronu i negatywnym wpływem na spermatogenezę. Substytucja testosteronu jest surowo przeciwwskazana z powodu supresji trwającej spermatogenezy. U mężczyzn ze stężeniem testosteronu <300 ng/dl dla poprawy wyników pobrań sugerowane było przedoperacyjne leczenie z użyciem inhibitorów aromatazy i cytrynianu klomifenu. Chociaż ostateczne wnioski wydają się niemożliwe do wyciągnięcia, niektórzy mężczyźni z NOA i zróżnicowaną aktywnością wewnątrzjądrową androgenów, jak również pacjenci z zespołem Klinefeltera mogą odnieść korzyść z pobrania. Wstępne badania także dostarczają dowodów, że dochodzi do stymulacji spermatogenezy przed TESE, gdy zastosuje się leczenie hormonalne w oparciu o ludzką gonadotropinę kosmówkową, a przez to wzrost koncentracji wewnątrzjądrowego testosteronu.

Pozyskanie nasienia jako pierwszy krok do wspomaganego rozrodu

Azoospermia jest najważniejszym wskazaniem do chirurgicznego pobrania nasienia. Azoospermia jest obecna u 1% ogólnej populacji i do 15% w populacji niepłodnych mężczyzn. Niestety różnicowanie pomiędzy obstrukcją a niewydolnością jąder nie zawsze jest proste, zwłaszcza gdy obstrukcja jest przeoczona w czasie badania klinicznego. Dlatego konieczne jest w każdym przypadku dokładne badanie andrologiczne przed rozważaniem pobrania nasienia, włączając w to wywiad w kierunku wnętrostwa, hipogonadyzmu hipogonadotropowego i chemioterapii. Ostatnie próby w kierunku poszukiwania czynników predykcyjnych to między innymi ocena ultrasonograficzna głowy najądrzy oraz badanie MRI jąder. Przyszłe próby poszukiwań mogą opierać się o ocenę proteomu i analizę mikroRNA plazmy nasienia jako potencjalnych biomarkerów istnienia spermatogenezy.

Wszystkie techniki wspomaganego rozrodu oparte na chirurgicznym pobraniu spermatyd/plemników do IVF/ICSI uwzględniają leczenie obojga partnerów. Kobieta powinna przejść stymulację jajników z następczym pobraniem oocytów. Zwłaszcza w NOA nieskuteczne pobranie TESE waha się w granicach 40-60%. Nieakceptowane jest wysokie ryzyko niepotrzebnego pobrania oocytów, z wszystkimi etycznymi i emocjonalnymi ich aspektami. Dlatego autorzy omawianego artykułu zdecydowali się na pobieranie spermatyd z jąder tylko do procedur niesynchronicznych, przez co krioprezerwacja jest przeprowadzana we wszystkich przypadkach. W przypadku OA nie ma różnicy w wynikach ICSI niezależnie czy używa się mrożonych i rozmrażanych czy też świeżych plemników, dlatego autorzy ograniczyli użycie świeżego materiału tylko na specjalne życzenie pary. Po MESA i bezpośredniej ocenie mikroskopowej z identyfikacją żywych, ruchliwych plemników w mikroskopie z kontrastem fazowym istnieje możliwość podziału próbki do różnych przeznaczeń.

Krioprezerwacja przeddojrzewaniowej tkanki jądrowej do transplantacji k omórek rozrodczych w przyszłości

U chłopców w wieku przed dojrzewaniem, u których planuje się chemioterapię z powodu nowotworu, opcją terapeutyczną jest transplantacja komórek macierzystych spermatogonium, z powodu wysokiej szansy przeżycia po chemioterapii. Używając TESE chroniącego tkanki (np. M-TESE) i krioprezerwacji tkanki jądrowej, wypracowano ulepszone techniki przechowywania i krioprotokoły. W przyszłości może być proponowana transplantacja komórek macierzystych po wyleczeniu choroby nowotworowej.

Kompleksowe centra medycyny reprodukcyjnej

Techniki pozyskania nasienia są dobrze zdefiniowane, wymagają szczegółowych badań obojga partnerów i bliskiej współpracy specjalistów technik wspomaganego rozrodu. Z tego powodu pobranie nasienia powinno być wykonywane wyłącznie w kompleksowych centrach medycyny reprodukcyjnej, z dużym doświadczeniem w badaniach andrologicznych i analizie nasienia. Dla optymalnego wyniku konieczny jest dostęp do narzędzi mikrochirurgicznych, wyspecjalizowany zespół z umiejętnościami mikrochirurgicznymi, możliwa śródoperacyjna ocena mikroskopowa pozyskanego materiału, kriobanking oraz kompleksowa ocena histopatologiczna i laboratoryjna nasienia pobranego w materiale TESE. Idealnie byłoby, gdyby wszyscy pacjenci mieli dostęp do centrów, które mają możliwość prowadzenia całego spektrum diagnostyki i terapii.

Oprac.: dr n. med. Piotr Paweł Świniarski
Kliniczny Oddział Urologii i Onkologii Urologicznej
10. Wojskowy Szpital Kliniczny z Polikliniką w Bydgoszczy

koordynator oddziału: lek. Waldemar Dudzic