| ||||||||||||||||||||
Ekspresja O-GlcNAc transferazy i β-N-acetylo-D-glukozaminidazy w nowotworach gruczołu krokowegoPierwsza nagroda na CEM 2011 w Timisoarze
Jacek Wilkosz
Michał Markowski Marek Lipiński Anna Krześlak Ewa Forma Magdalena Bryś Waldemar Różański W populacji amerykańskiej rak gruczołu krokowego (PCa) jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym i drugą, co do częstości, przyczyną zgonów z powodów nowotworowych u mężczyzn [1]. Specyficzny antygen sterczowy (PSA) jest szeroko stosowanym markerem w diagnostyce PCa. Mimo że w większości jest produkowany przez komórki stercza, jest narządowo swoisty - jego podwyższone stężenie w surowicy krwi obserwujemy również w innych niż PCa chorobach gruczołu krokowego, takich jak łagodny rozrost stercza (BPH) czy zapalenie stercza. Stężenie PSA całkowitego w surowicy krwi nie pozwala również na różnicowanie pomiędzy agresywnymi nowotworami gruczołu krokowego a rakami stercza o małym znaczeniu klinicznym, a także nie koreluje w sposób dostatecznie dokładny z rozmiarem guza, jego miejscowym stopniem zaawansowania lub potencjałem do tworzenia przerzutów odległych. Istnieje potrzeba identyfikacji nowych markerów, które skutecznie pomogą rozstrzygnąć powyższe kwestie oraz będą przydatne w codziennej praktyce klinicznej, poprawiając wyniki odległe leczenia radykalnego i/lub zmniejszając liczbę pacjentów niepotrzebnie poddanych takiemu leczeniu. Powszechną modyfikacją białek komórkowych jest glikozylacja polegająca
na przyłączeniu pojedynczych reszt β-Nacetylo-D-glukozaminy
(O-GlcNAc) do reszt seryny lub treoniny wchodzących
w skład polipeptydów (O-GlcNAcylacja) wiązaniem O-glikozydowym.
Modyfikacji tej dokonuje enzym O-GlcNAc transferaza (OGT)
[2-4]. Enzymem usuwającym reszty O-GlcNAc z białek jądrowych
i cytoplazmatycznych jest β-Nacetylo-D-glukozaminidaza (OGA).
Sekwencja sklonowanej β-Nacetylo-D-glukozaminidazy po raz
pierwszy została zidentyfikowana jako sekwencja odpowiadająca
antygenowi 5, ulegającemu ekspresji w komórkach oponiaka (meningioma
expressed antigen 5 - MGEA5), powodującemu u pacjentów
odpowiedź immunologiczną. Największą ekspresją tego enzymu
charakteryzują się mózgowie, łożysko i trzustka, a także gruczoł
sutkowy i pęcherz moczowy [5, 6]. Celem podjętych badań była ocena ekspresji O-GlcNAc transferazy (OGT) i β-Nacetylo-D-glukozaminidazy (MGEA5, OGA), na poziomie mRNA metodą real-time PCR oraz korelacja uzyskanych wyników z cechami kliniczno-patologicznymi. Materiał Materiał użyty do badań pochodził z II Kliniki Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi i został uzyskany na drodze przezodbytniczej, wielokrotnej, rdzeniowej biopsji stercza nadzorowanej USG endorektalnym, po uzyskaniu świadomej zgody pacjentów poddanych biopsji. Materiał do badań bezpośrednio po pobraniu został zamrożony i przechowywany w temperaturze -80°C do chwili przeprowadzenia oznaczeń. Uzyskane wyniki histopatologiczne w badanej grupie 155 pacjentów były następujące: 33 pacjentów - stercz prawidłowy, 40 pacjentów - BPH, 9 pacjentów - nowotworowy rozrost śródnabłonkowy stercza (PIN) oraz 73 pacjentów - rak stercza (PCa). Przypadki PCa sklasyfikowano według stopnia zaawansowania klinicznego (cecha cT) oraz pod względem zróżnicowania histologicznego. W 24 przypadkach były w stopniu cT1, w 26 przypadkach w stopniu cT2, w 5 przypadkach w stopniu cT3 i w 18 przypadkach w stopniu cT4. W 45 przypadkach sumaryczny stopień złośliwości w skali Gleasona (suma Gleasona) wynosił ≤7 i w 28 przypadkach >7. Średnia wieku pacjentów wynosiła 62 lata, a przedział wiekowy 41-83. Metoda Oceny ekspresji O-GlcNAc transferazy (OGT) i β-Nacetylo-D-glukozaminidazy (MGEA5, OGA), na poziomie mRNA dokonano metodą real-time PCR. Izolowanie RNA i synteza cDNA
Analiza ilościowa produktu amplifikacji w czasie rzeczywistym
- reakcja real-time PCR Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real-timei PCR dla oznaczenia liczby kopii mRNA dla genów OGT i MGEA5. Użyta mieszanina reakcyjna zawierała: 0,5 μl cDNA, 5 μl TaqMan® Universal PCR MasterMix, 0,5 μl 20x TaqMan® Gene Expression Assays i 4 μl H2O. Reakcję real-time PCR prowadzono w urządzeniu Mastercycler ®ep realplex (Eppendorf). Profil termiczny reakcji obejmował denaturację wstępną w temperaturze 95°C przez 10 minut, a następnie 40a cykli obejmujących inkubację przez 15 sekund w temperaturze 95°C oraz 1 minutę w temperaturze 60°C.
Początkowa ilość matrycy wyznaczana była na podstawie parametru Ct (teoretyczny numer cyklu, przy którym wartość fluorescencji jest wyższa niż przyjęta arbitralnie wartość graniczna). Wszystkie badane próbki, w których stwierdzono ekspresję genu, wykazały wartość fluorescencji wyższą niż graniczna przy liczbie cykli mniejszej niż 30. Pomiar wartości Ct wykonano w dwóch powtórzeniach, jako gen referencyjny wykorzystano dehydrogenazę aldehydu-3-fosfoglicerynowego (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase - GAPDH) - enzym metabolizmu podstawowego występujący w każdej żywej komórce organizmu. Do badań zastosowano następujące sondy TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA): OGT - Hs00269228, MGEA5 - Hs00201970, GAPDH - Hs00266705_g1. Analiza statystyczna Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu programu komputerowego STATISTICA wersja 9.0 (StatSoft, Poland). Do oceny rozkładów wykorzystano test Kolmogorova-Smirnova i po stwierdzeniu rozkładów odmiennych od normalnych do dalszych obliczeń stosowano testy nieparametryczne: U Manna-Whitneya i Kruskala- -Wallisa. Za statystycznie istotną przyjęto wartość p <0,05. Wyniki Oceniono ekspresję O-GlcNAc transferazy (OGT) i b-N-acetylo- -D-glukozaminidazy (MGEA5, OGA), na poziomie mRNA metodą real-time PCR w 40 preparatach BPH, 9 preparatach PIN, 73 preparatach PCa oraz w 33 preparatach stercza prawidłowego. Ekspresję OGT stwierdzono w 23 preparatach stercza prawidłowego (78,8%), 32 preparatach BPH (80,0%), 8 preparatach PIN (88,9%) i 66 preparatach PCa (90,4%). Ponadto uzyskane wyniki wskazują na wyższą ekspresję genu OGT w PCa w porównaniu ze zmianami łagodnymi gruczołu krokowego oraz z materiałem prawidłowym (wykres 1A). Średnia ekspresja genu OGT w preparatach PCa była 3,77; 3,05 i 2,19 razy wyższa niż, odpowiednio, w materiale prawidłowym, BPH i PIN. Znamienny statystycznie był wzrost ekspresji genu OGT wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania miejscowego PCa (wykres 2), a także znamienny statystycznie wzrost ekspresji genu OGT wraz ze wzrostem stopnia złośliwości nowotworu. W grupie raków z sumarycznym stopniem w skali Gleasona >7, ekspresja genu OGT była wyższa niż w grupie z sumarycznym stopniem w skali Gleasona ≤7 (p <0,01) (wykres 3).
Nie wykazano znamiennych statystycznie różnic w ekspresji genu MGEA5 między tkanką prawidłową, BPH, PIN i PCa (wykres 1B). Natomiast ekspresja MGEA5 okazała się być wyższa w rakach sklasyfikowanych jako cT4, w porównaniu do stadium cT1 (p <0,05), a także w grupie raków scharakteryzowanych jako sumaryczny stopień w skali Gleasona >7, była wyższa niż w grupie z sumarycznym stopniem w skali Gleasona ≤7 (p <0,05). Tabela 1 przedstawia zestawienie ekspresji genów OGT i MGEA5 w preparatach PCa, w odniesieniu do wybranych cech kliniczno- -patologicznych. Wnioski Uzyskane przez nas wyniki pozwalają wnioskować o tym, iż postępującej transformacji nowotworowej gruczołu krokowego oraz miejscowej progresji PCa może towarzyszyć zwiększona ekspresja genów zaangażowanych w proces O-GlcNAcylacji. Ekspresja genu OGT wydaje się być szczególnie interesująca w kontekście jego zastosowania jako biomarkera w diagnostyce PCa. dr n. med. Jacek Wilkosz Piśmiennictwo
|
||||||||||||||||||||
