Przegląd Urologiczny 2008/4 (50) wersja do druku | skomentuj ten artykuł | szybkie odnośniki
 
strona główna > archiwum > Przegląd Urologiczny 2008/4 (50) > Varia

Varia

Dendritic Cell-Tumor Fusion Vaccines for Renal Cell Carcinoma

Rak nerki (RCC - ang. renal cell cancer) jest nowotworem, który wykazuje znaczną oporność na chemioterapię. Ocenia się, że remisja całkowita po próbach leczenia chemicznego nie przewyższa 10%, bez uwzględniania sorafenibu. RCC wykazuje do pewnego stopnia skłonność do remisji po zastosowaniu leczenia opartego na mechanizmach immunologicznych. W badaniach z użyciem interleukiny 2 (IL-2) chorzy otrzymujący wysokie dawki IL-2 osiągali do 30% remisji całkowitej i do 11% odpowiedzi częściowej. Niestety, problemem pozostaje wysoka toksyczność tego rodzaju leczenia. Do chwili obecnej udało się określić wiele antygenów związanych z nowotworem nerki, które rozpoznawane są przez limfocyty cytotoksyczne (CTL), takie jak: RAGE-1, PRAME, Her-2/neu, G250, gp-100, telomeraza, MUC-1. Pomimo tak zaawansowanych prac nie udało się doprowadzić do całkowitego wyleczenia chorych, u których nastąpił nawrót bądź rozsianie RCC wyłącznie metodą leczenia zachowawczego. Najprawdopodobniej u podstaw takiego stanu rzeczy leży brak wystarczającej znajomości odpowiednich sygnałów kostymulujących limfocyty T. Obiecująco rysują się podejścia immunoterapeutyczne oparte na szczepionkach przeciwnowotworowych, które mogą wpływać na odporność immunologiczną gospodarza i indukować tworzenie swoistych mechanizmów przeciwnowotworowych. Komórki dendrytyczne są komórkami prezentującymi antygen, które mają unikalne właściwości generowania pierwotnej odpowiedzi immunologicznej dzięki ekspresji cząsteczek kostymulujących limfocyty oraz cząsteczek adhezyjnych niezbędnych do aktywacji limfocytów dziewiczych. Funkcja komórek dendrytycznych zależy od stopnia ich dojrzewania. Niedojrzałe komórki dendrytyczne rezydują w miejscach wychwytu antygenów (skóra, nabłonek oskrzelików płucnych, nabłonek jelit), gdzie zaangażowane są w proces ich internalizacji i obróbki. Po związaniu antygenu komórki te migrują do miejsc typowych dla limfocytów T, tracą właściwości fagocytozy i zwiększają ekspresję cząsteczek kostymulujących. Komórki dendrytyczne są uzyskiwane ze szpiku po stymulacji ich prekursorów cytokinami z krwi obwodowej lub krwi pępowinowej. Modyfikacje komórek dendrytycznych tak, by prezentowały antygeny nowotworowe, wpływają na indukowanie odporności przeciwnowotworowej. Rozwinięto różne modele postępowania wiodące do wprowadzenia antygenów raka do komórek dendrytycznych. Badania na modelu zwierzęcym wykazały, że komórki dendrytyczne karmione swoistymi dla nowotworu peptydami lub białkami powodują oporność zwierząt na późniejsze podawanie komórek nowotworowych lub eradykację nowotworu u zwierząt już dotkniętych rakiem. Skuteczne szczepionki opierały się również na transdukowanych genami nowotworowymi z użyciem wektorów retro- i adenowirusowych komórkach dendrytycznych oraz komórkach dendrytycznych karmionych swoistymi dla nowotworu RNA. Wszystkie z wymienionych strategii bazują na znanych antygenach nowotworowych ułatwiających rozwój nowotworu (np. zmniejszanie ekspresji antygenu przez komórki nowotworowe). Wśród metod, które być może przyniosą rozwiązanie tego problemu, wyróżnia się karmienie komórek dendrytycznych lizatami komórek nowotworowych, kompletnymi cząsteczkami RNA nowotworowego lub ciałkami apoptotycznymi.

Badania z użyciem komórek dendrytycznych w leczeniu chorych na RCC˙

Badania przeprowadzone z udziałem chorych na RCC metodą immunoterapii złożonej z komórek dendrytycznych przyniosły następujące wyniki: osiągnięto 58% grupę ze stabilizacją choroby i 7% z całkowitą regresją. Należy jednak dobitnie podkreślić, że badaniem objęto grupę chorych o niewielkiej liczebności.

Badania na modelu mysim z użyciem szczepionki złożonej z hybrydy komórek dendrytycznych i komórek nowotworowych

Hybrydy powstałe poprzez fuzję komórek dendrytycznych z komórkami nowotworowymi wykazują ekspresję antygenów swoistych dla guza oraz cząsteczek kostymulujących charakterystycznych dla komórek prezentujących antygen. W badaniach na zwierzętach szczepionki takie doprowadzały do regresji choroby nowotworowej, a efekt był potęgowany przez adjuwantowe podawanie cytokin (np. interleukiny 12). Niemniej, komórki dendrytyczne izolowane od zwierząt z nowotworem cechowały się gorszym potencjałem terapeutycznym; różnicy tej nie odnotowano po fuzji z komórkami nowotworowymi i utworzeniu hybryd. Jednakże hybrydy niedojrzałych komórek dendrytycznych w porównaniu z hybrydami dojrzałych komórek były mniej skuteczne w generowaniu przeciwnowotworowych substancji biologicznych (np. CTL). Hybrydy były tworzone przy użyciu glikolu polietylenowego (PEG) lub technik fizycznych takich jak elektrofuzja. Tak otrzymane hybrydy efektywnie migrowały do węzłów chłonnych.

Badania przedkliniczne obejmujące niewielkie grupy ściśle dobranych chorych na zaawansowanego RCC, dotyczące zastosowania szczepionki złożonej z fuzji komórek dendrytycznych i komórek nowotworowych wskazały, że hybrydy efektywniej i skuteczniej stymulują swoistą odpowiedź przeciwnowotworową w porównaniu z komórkami odżywianymi wyłącznie peptydami

Badania kliniczne szczepionki utworzonej z hybryd komórek dendrytycznych i komórek nowotworowych R

Komórki dendrytyczne izolowane są z krwi obwodowej metodą leukaferezy i hodowane przez jeden tydzień w pożywce z dodatkiem GM-CSF, IL-4 oraz autologicznej surowicy. Po połączeniu z komórkami nowotworowymi z użyciem PEG, na podstawie analizy FACS ocenia się liczbę powstałych hybryd. Podskórne podawanie szczepionki (1x10 6, 2x10 6 lub 4x10 6 hybryd) co 3 tygodnie (3 dawki) u chorych na RCC nie wywoływało efektów toksycznych, z wyjątkiem objawów niepożądanych (reakcje zapalne w miejscu podania, przejściowa gorączka, bóle mięśniowe, objawy grypopodobne, świąd, zmęczenie, obwodowe obrzęki, wysypka, przejściowe podwyższenie miana przeciwciał przy braku oznak choroby autoimmunizacyjnej). Swoistą odpowiedź przeciwnowotworową oceniano metodą pomiaru wewnątrzkomórkowej ekspresji IFN. przez limfocyty T po ekspozycji in vitro na lizaty nowotworowe. Spośród chorych objętych badaniem 5/13 osiągnęło stabilizację choroby w okresie od 3 do 9 miesięcy, a u 7/13 i 10/13 szczepienie spowodowało dwukrotny wzrost reaktywnych limfocytów odpowiednio CD8 i CD4.

W dalszym ciągu oczekujemy na wyniki badań wskazujących na wpływ adjuwantów cytokinowych i stymulacji dojrzewania komórek dendrytycznych w działaniu szczepionek przeciwnowotworowych.

Immunoterapia nowotworów urologicznych: przegląd aktualnych metod doświadczalnych

Basic overview of current immunotherapy approachesin urologic malignancy

Obserwuje się dynamiczny wzrost liczby badań klinicznych poświęconych zastosowaniu szczepionek przeciwnowotworowych złożonych z komórek dendrytycznych odżywianych peptydami lub białkami, genetycznie zmodyfikowanych wirusów, czystego DNA oraz komórek nowotworowych zmodyfikowanych do wydzielania prozapalnych cytokin. Wszystkie te metody opierają się na wykorzystaniu systemu immunologicznego chorych celem wyeliminowania rozwijającego się guza.

Przeciwciała monoklonalne

Fagocytoza komórek nowotworowych lub ich antygenów przebiega znacznie szybciej, gdy są one otoczone przeciwciałami (tzw. opsonizacja). W leczeniu nowotworów urologicznych liczne substancje są nadal przedmiotem intensywnych badań, np. humanizowane przeciwciało przeciw błonowemu antygenowi swoistemu dla stercza (PSMA) - HuJ591; jest ono dobrze tolerowane przez chorych, a po jego zastosowaniu uzyskuje się stabilizację stężenia PSA. Skoniugowane z przeciwciałami monoklonalnymi związki emitujące promieniowanie beta, Itr Y90 i Jod J111, wywierają bezpośredni efekt cytotoksyczny na komórki w okolicy guza i w tym mechanizmie wzmagają uwalnianie antygenów z martwych komórek nowotworowych.

Aktywacja komórek dendrytycznych - cytokiny

Zanim komórki dendrytyczne doprowadzą do prezentacji swoistego antygenu i aktywacji limfocytów T, same muszą ulec uaktywnieniu na drodze wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych szlaków. Szczepionki oparte na komórkach dendrytycznych chorego na raka, które są odżywiane peptydami lub białkami autologicznego nowotworu, takie jak DCVax i Provenge, wpływają bezpośrednio na dojrzewanie i aktywację komórek dendrytycznych chorych w warunkach ex vivo. Wymagają one zastosowania plazmaferezy oraz hodowli uzyskanych komórek przed podaniem ich do organizmu. W badaniach III fazy Provenge przeprowadzonych u chorych na przerzutowego, hormonoopornego raka gruczołu krokowego wskazano na korzyści kliniczne w przypadku punktacji Gleasona <=7. Inna metoda aktywacji komórek dendrytycznych polega na stymulacji cytokinami. Aktywację i migrację tych komórek silnie promuje zwłaszcza GM-CSF. Auto logiczne lub allogeniczne komórki nowotworowe zmodyfikowane genetycz nie do wydzielania GM-CSF lub interleukiny 12 zawiera pre parat GVAX. GM-CSF może być również podawany jako jedyny preparat, ponieważ egzogenny GM-CSF aktywuje endogenne komórki prezentujące antygen (APC) i modyfikuje niewystarczającą odpowiedź immunologiczną.

Aktywacja komórek dendrytycznych - receptory TLR i białka szoku cieplnego

Aktywacja komórek dendrytycznych może odbywać się poprzez tzw. wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), rozpoznawane przez receptory Toll-podobne (TLR). Szczepionka BCG podawana dopęcherzowo wywołuje pobudzenie miejscowych APC poprzez rozpoznawanie bakteryjnych lipopolisacharydów z udziałem receptorów TLR-4 i TLR-2. TLR-9 rozpoznaje z kolei unikalne sekwencje DNA bakteryjnego, zawierające niemetylowane sekwencje złożone z cytozyny i guaniny CpG. Badania I/II fazy, które są obecnie w toku, skupiają się nad użyciem CpG (ProMune) w leczeniu zaawansowanego raka nerki w stadium IV.

Komórki dendrytyczne podlegają również aktywacji w chwili uwalniania przez martwe komórki białek szoku cieplnego (HSP), czyli protein, których ekspresja rośnie w komórkach poddawanych stresowi. HSP-96 wzmaga odpowiedź immunologiczną poprzez przenoszenie antygenów z martwych komórek nowotworowych do APC; trwają badania kliniczne fazy III w raku nerki (Oncophage) oparte na tej właściwości HSP-96. Celem uzyskania właściwego HSP dla odpowiedniego chorego fragment guza musi zostać wykorzystany do izolacji białek.

Aktywacja limfocytów pomocniczych CD4

Bezpośrednio po aktywacji komórki dendrytyczne migrują do węzłów chłonnych, gdzie włączają do odpowiedzi immunologicznej limfocyty CD4 i CD8. Po wstrzyknięciu komórek dendrytycznych jako szczepionki jedynie niewielka ich ilość migruje do węzła chłonnego, gdzie poprzez cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy II antygen prezentowany jest limfocytom CD4 w tzw. prezentacji bezpośredniej. W prezentacji krzyżowej antygen jest pobierany z układu szczepionkowego przez komórki dendrytyczne chorego i prezentowany limfocytom T. Do pełnej aktywacji limfocyty CD4 potrzebują 2 sygnasygnałów. Pierwszy jest zapewniony przez kompleks receptora limfocytu T i peptydu związanego z cząsteczką MHC. Kostymulacja odbywa się przez interakcję między cząsteczką B7-1 na APC i CD28 na limfocycie T. Bez tego drugiego sygnału limfocyt nie zostanie aktywowany, a nawet może ulec zniszczeniu.

Jedną ze strategii stosowanej w badaniach nad szczepionkami komórkowymi jest dążenie do nasilenia tego drugiego sygnału przez produkty zmodyfikowanego materiału genetycznego wirusa, gdzie ekspresji ulegają zarówno cząsteczki kostymulujące, jak i odpowiednie peptydy będące antygenami. W leczeniu raka stercza szczepionka (ProstVac), zawierająca triadę cząsteczek kostymulujących (B7-1, LFA-1 i ICAM) wbudowaną do genomu poxvirusa wraz z sekwencją kodującą PSA, przeszła z sukcesem badania I i II fazy.

Aktywacja limfocytów cytotoksycznych CD8

Limfocyty CD8 odpowiadają za lizę docelowych komórek nowotworowych. Ulegają aktywacji w podobny sposób do limfocytów CD4, ale w skład kompleksu aktywującego wchodzi cząsteczka MHC klasy I. Po aktywacji komórki te opuszczają węzeł i udają się w miejsce guza, gdzie komórki nowotworowe rozpoznawane są w swoisty sposób. Uważa się, że limfocyty CD4 są niezbędne do tego, by umożliwić limfocytom CD8 uzyskanie pełnej litycznej aktywności w stosunku do komórek nowotworowych. Wyniki najnowszych badań wskazują, że limfocyty CD8 o niskim powinowactwie cechuje niska skuteczność przeciwnowotworowa, która znacząco zwiększa się w obecności swoistych dla komórek nowotworowych limfocytów CD4. Jednorazowa aktywacja limfocytów CD8 umożliwia silną aktywność przeciwnowotworową, nawet przeciw komórkom nowotworowym lekoopornym. Komórki CD8 mogą być zatem aktywowane ex vivo i podawane dożylnie temu samemu choremu (tzw. immunoterapia adoptywna).

Funkcja efektorowa limfocytów CD8

Limfocyty CD8 niszczą komórki poprzez uwalnianie ziaren zawierających perforyny, generujące pory w błonie, oraz granzymy, indukujące apoptozę. Oprócz obecności swoistych dla guza limfocytów efektorowych do osiągnięcia celu leczenia konieczny jest szereg zależnych od siebie czynników. Jedną z cytokin silnie upośledzających migrację komórek do guza jest transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-beta), którego stężenie zwiększa się znacznie u chorych na zaawansowanego raka stercza. Limfocyty CD8 transformowane ex vivo genem dominującym dla nieaktywnego receptora dla TGF-beta nie podlegają sygnałom hamującym przenoszonym przez tę cytokinę. Podane do organizmu dotkniętego rakiem, limfocyty T mogą przemieszczać się w obręb nowotworu i skutecznie niszczyć obce dla ustroju komórki.

Funkcja efektorowa limfocytów NK

Limfocyty NK są subpopulacją limfocytów uważaną za część nieswoistej odporności wrodzonej. Rozpoznają i niszczą zainfekowane wirusem komórki, które utraciły cząsteczki MHC klasy I na swojej powierzchni. Mogą one również działać jako część odporności swoistej zaangażowanej w cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC), gdzie komórki opłaszczone przeciwciałami są niszczone przez komórki efektorowe. Mechanizm ADCC jest wykorzystywany w terapii poprzez zastosowanie przeciwciał monoklonalnych przeciw cząsteczkom powierzchniowym występującym na komórkach nowotworowych. Antygen HER-2/neu obecny poza rakiem sutka na powierzchni komórek raka stercza jest punktem uchwytu dla trastuzumabu (Herceptin) u chorych z hormonoopornym rakiem stercza. Terapia ta w badaniach II fazy była dobrze tolerowana, ale osiągnięto niewielką skuteczność. Warto jednak podkreślić, że przeciwciała monoklonalne przeciw PMSA lub sterczowej kwaśnej fosfatazie mogą być wartościowe w przypadku leczenia opartego na ADCC.

Generacja limfocytów CD8 pamięci

Przy stałej obecności antygenu limfocyty CD8 nie mogą przekształcić się w komórki pamięci immunologicznej, co jest kluczowe dla efektywnej eliminacji guza. Rozwija się pewien rodzaj tolerancji z powodu wysokiego poziomu antygenów, który prowadzi do delecji limfocytów CD8. W raku stercza ablacja androgenowa daje unikalną możliwość do zweryfikowania tej tezy. W badaniach klinicznych ablacja androgenowa powodowała wzmożoną migrację limfocytów T do gruczołu krokowego. W modelu zwierzęcym wykazano z kolei, że brak odpowiedzi na szczepionkę komórkową mógł zostać przezwyciężony przez ablację androgenową.

Limfocyty T regulatorowe

Limfocyty CD4+ CD25+ nazywane są limfocytami regulatorowymi (Treg). Ich blokada lub zmniejszenie ich liczby wzmacnia efektywność szczepionki w modelach doświadczalnych, także w raku stercza. Blokada tych limfocytów może odbywać się poprzez użycie swoistego przeciwciała monoklonalnego przeciw CTLA-4 (MDX010), sprzęgniętej z przeciwciałem toksyny (Denileukin difitox) lub blokady cząsteczki swoistej dla Treg - Lag-3.

Selekcja antygenów, które mają być celem dla immunoterapii

Antygeny, które mogą być celem dla immunoterapii, można podzielić na występujące:

1. zarówno na prawidłowych komórkach, jak i komórkach nowotworowych (w raku stercza: PSA, PSMA, sterczowa fosfataza kwaśna);

2. na komórkach nowotworowych, nieobecne na prawidłowych komórkach (węglowodanowy fragment MUC1, telomeraza).

Większość szczepionek uwzględnia pojedyncze białko (lub peptyd), czego pokłosiem są częste niepowodzenia leczenia, głównie z powodu zjawiska ucieczki antygenowej nowotworu w wyniku zmniejszania przez komórki nowotworowe ekspresji danego białka lub peptydu. Niektóre szczepionki komórkowe unikają tego zagrożenia przez prezentację dużej liczby antygenów, np. przez fuzję komórki nowotworowej i komórki dendrytycznej. Pomimo tego racjonalna selekcja antygenów mających być celem dla immunoterapii pozostaje nadal wyzwaniem.

Obecność takich zjawisk jak utrata antygenów, obecność komórek Treg, anergia limfocytów T czy dysfunkcja komórek dendrytycznych stoi nadal na przeszkodzie do stworzenia szczepionki komórkowej skutecznej w walce z komórkami nowotworowymi. Być może w przyszłości dążenia do zmniejszenia objętości guza i modulacji szlaków regulatorowych zbliżą nas do sukcesu wyrażonego skutecznością leczenia zachowawczego chorych na raka. Wykaz niektórych zastosowanych skrótów: APC - antigen presenting cells, GM-CSF - granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, PAMP - pathogen associated molecular patterns, ADCC - antibody dependent cell-mediated cytotoxicity